膜间隙
线粒体膜间隙是线粒体外膜与线粒体内膜之间的空隙，宽约6-8nm，其中充满无定形液体。由于线粒体外膜含有孔蛋白，通透性较高，而线粒体内膜通透性较低，所以线粒体膜间隙内容物的组成与细胞质基质十分接近，含有众多生化反应底物、可溶性的酶和辅助因子等。线粒体膜间隙中还含有比细胞质基质中浓度更高的腺苷酸激酶、单磷酸激酶和二磷酸激酶等激酶，其中腺苷酸激酶是线粒体膜间隙的标志酶。线粒体膜间隙中存在的蛋白质可统称为“线粒体膜间隙蛋白质”，这些蛋白质全部在细胞质基质中合成。
内膜
线粒体内膜是位于线粒体外膜内侧、包裹着线粒体基质的单位膜。线粒体内膜中蛋白质与磷脂的质量比约为0.7：0.3，并含有大量的心磷脂（心磷脂常为细菌细胞膜的成分）。线粒体内膜的某些部分会向线粒体基质折叠形成线粒体嵴。线粒体内膜的标志酶是细胞色素氧化酶。
线粒体通过向内凹形成嵴，从而来增加内膜面积。然后是更多的反应能在内膜上进行。
线粒体内膜含有比外膜更多的蛋白质（超过151种，约占线粒体所含所有蛋白质的五分之一），所以承担着更复杂的生化反应。存在于线粒体内膜中的几类蛋白质主要负责以下生理过程：特异性载体运输磷酸、谷氨酸、鸟氨酸、各种离子及核苷酸等代谢产物和中间产物；内膜转运酶（translocaseoftheinnermembrane，TIM）运输蛋白质；参与氧化磷酸化中的氧化还原反应；参与ATP的合成；控制线粒体的分裂与融合。
嵴
线粒体嵴简称“嵴”，是线粒体内膜向线粒体基质折褶形成的一种结构。线粒体嵴的形成增大了线粒体内膜的表面积。在不同种类的细胞中，线粒体嵴的数目、形态和排列方式可能有较大差别。线粒体嵴主要有几种排列方式，分别称为“片状嵴”（lamellarcristae）、“管状嵴”（tubularcristae）和“泡状嵴”（vesicularcristae）。片状排列的线粒体嵴主要出现在高等动物细胞的线粒体中，这些片状嵴多数垂直于线粒体长轴；管状排列的线粒体嵴则主要出现在原生动物和植物细胞的线粒体中。有研究发现，睾丸间质细胞中既存在层状嵴也存在管状嵴。线粒体嵴上有许多有柄小球体，即线粒体基粒，基粒中含有ATP合酶，能利用呼吸链产生的能量合成三磷酸腺苷。所以需要较多能量的细胞，线粒体嵴的数目一般也较多。但某些形态特殊的线粒体嵴由于没有ATP合酶，所以不能合成ATP。
基质
线粒体基质是线粒体中由线粒体内膜包裹的内部空间，其中含有参与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等生化反应的酶等众多蛋白质，所以较细胞质基质黏稠。苹果酸脱氢酶是线粒体基质的标志酶。线粒体基质中一般还含有线粒体自身的DNA（即线粒体DNA）、RNA和核糖体（即线粒体核糖体）。
线粒体DNA是线粒体中的遗传物质，呈双链环状。一个线粒体中可有一个或数个线粒体DNA分子。线粒体RNA是线粒体DNA的表达产物，RNA编辑也普遍存在于线粒体RNA中，是线粒体产生功能蛋白所必不可少的过程。线粒体核糖体是存在于线粒体基质内的一种核糖体，负责完成线粒体内进行的翻译工作。线粒体核糖体的沉降系数介干55S-56S之间。一般的线粒体核糖体由28S核糖体亚基（小亚基）和39S核糖体亚基（大亚基）组成。在这类核糖体中，rRNA约占25%，核糖体蛋白质约占75%。线粒体核糖体是已发现的蛋白质含量最高的一类核糖体。线粒体基质中存在的蛋白质统称为“线粒体基质蛋白质”，包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、柠檬酸合成酶以及三羧酸循环酶系中的酶类。大部分线粒体基质蛋白是由核基因编码的。
